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纸色谱分离氨基酸实验原理详解

2019-10-28 16:20:04      点击:

     纸色谱分离氨基酸实验作为化学、食品、医药、生物等专业的重要必修实验之一,虽其方法简单易行,但其实验原理却较难理解,其中涉及了有机、分析、物化各化学分支的诸多基础知识。可是各版本教材限于篇幅,对某些知识的解释并不可能面面俱到,这造成了学生的理解障碍,即便是获得了完美的实验结果,却仍 然对 该 实 验 原 理 一 知 半解。而且,纸色谱的工作原理是学生在本科阶段深入学习色谱知识的重要基础,而学生有限的化学专业基础知识并不能支撑其较好的理解这些内容,鉴于此,笔者综合了该实验在教材中未曾提及或点到为止的内容,集中进行详尽完整的解释,力求解决学生对该实验相关理论知识产生的一些困惑。

1 纸色谱基本工作原理简介

     纸色谱分离是利用被分离组分在互不相溶的两相中溶解度 (或分配系数)的不同,通过两相的相对运动而达到分离的目的,该法在教学中常用于分离氨基酸[1-5,7]、叶绿素[6]等混合样品 (如图1所示)。其中,层析滤纸为惰性支撑物,真正参与分配层析的是吸附在滤纸中的水,这 部 分 水 为 固 定相。以饱和了水的正丁醇溶液为流动相,并多用弱酸或弱碱调节其酸碱性。配好的展开剂要放在密闭层析缸内,一段时间达平衡后形成稳定的蒸汽相。将点好氨基酸标准样及其混合样并干燥后的滤纸悬挂在层析缸中,流动相靠毛细作用随即在滤纸上展开。当流动相流经固定相时,样品中各组分将在固定相和流动相中发生反复分配,因各组分在两相中溶解度 (或分配系数)的不同从而使其以不同速度向上移动,如图2所示。其中,在流动相中溶解度较大的组分 (▲),随流动相移动较快,反之则较慢 (■)。展开达到一定时间后,混合样品则得以分离。


     层析结束后,将滤纸取出,在流动相展开的最前端划线,称为展开前沿。吹干,喷茚三酮,再次吹干显色。测定点样 原 点 至 层 析 斑 点 中 心 的 距 离(d)及点样线到展开前沿的距离 (l)。在一定条件下,这2者的比值为一定值,即Rf=d/l。但实际上,实验条件难以控制到与文献条件完全相同,Rf值很难重现,故此采用将标准样和待测样置于相同层析条件下的内标法进行定性分析。

2 固定相的来源

     纸色谱固定相是吸附在滤纸纤维中的水,滤纸只是水的载体,然而水看不见摸不着,它究竟以何种形式固定在滤纸中,又来源于哪里,这些都成为学生理解纸色谱工作原理的最大困扰。要解决这个困扰,我们需要通过滤纸的化学成分及其组成结构来进行分析。

     层析滤纸由精选的无任何添加物的高纯棉短绒制成,纤维素含量接近100%。纤维素是由β-葡萄糖以β-1-4糖 苷 键 聚 合 而 成 的长链高分子化合物,对天然纤维素超分子结构的 X 射线衍射技术测试研究表明,纤维素由结晶区和无定型区交错形成。结晶区纤维素中β-葡萄糖单元环上的羟基通过氢键交联成网格,形成了致密的晶体结构;而在无定型区大部分β-葡萄糖单元环上的羟基仍有部分处于游离状态 (图3),可与吸附的水分子形成氢键,这部分水被称为 “结合水”[8],可达重量比的6%左右[5,9]。当水与纤维表面的羟基结合达到饱和时,水分子还可进入纤维的细胞腔或是更大的孔隙中,形成多层吸附水或是毛细管水,这 部 分 水 被 称 为“自由水”。在普通的纸张中,纤维素纤维的平均宽度为10~50μm,长度为0.7~4mm,形成的多孔网络尺寸从几十微米到毫米, “自由水”大多分布于此;而纤维素纤维又是由成束微纤维组成的,微纤维再 由 一 系 列 的 纤 维 链 组 成,直 径 约 10~20nm,长度可达数百微米,它们交错形成的孔隙仅有纳米尺度,一部分结合水可分布于这些孔隙中,另一部分则暴露于微纤维的表面[10]。对层析滤纸来说,“自由水”和 “结合水”的分布与普通纸张相似,但因其纤维纯度更高,疏松度好,吸水性能更 好, 吸 水 总 量 可 达 纸 张 总 重 量 的 20% ~25%[5,9]。因此,看起来很 “干”的滤纸实际上其含水量相当可观。某些国内色谱专著[9]认为只有滤纸中6%左右的结合水才是纸色谱的固定相,基于其与滤纸之间较强的氢键作用。然而,笔者查阅的国外论文[11]和英文专著[12-13]却未将 “结合水”和“自由水”加以区分,认为滤纸吸附水即为固定相。滤纸放置在含水的展开剂蒸气相中,其吸附水中必定含有 “自由水”,组分与水之间的溶解作用取决于结构中的极性和氢键等因素,但这些因素并不能令组分对滤纸中的 “自由水”及 “结合水”作出选择,即组分仅在结合水中发生分配。此外,如若“自由水”仅因与滤纸作用较弱,而无法固定在滤纸中成为固定相,那么这部分水在互不相溶且相对运动的固定相和流动相中就成了 “有害角色”,但从未见纸色谱分离效果的影响因素中提及其不利作用。因此,笔者认为滤纸中的吸附水,无论是 “自由水”还是 “结合水”,都是固定相。至于 “自由水”没有氢键的强作用力是否随流动相一起迁移,将在第4部分阐述。


3 层析滤纸的毛细作用

     层析滤纸的毛细作用是流动相克服重力作用向上展开的驱动力。制作层析滤纸所用的棉短绒是经碱法蒸煮、漂白、脱水、干燥等处理后得到的高纯度α-纤维素,其聚合度可达 200 以上,呈短柱状(图4)[14],内有中空腔 (图5)[15]。α-纤维素制成滤纸后,如前所述,亦将如普通纸张一样形成尺寸不一的孔隙,它们交联在一起形成狭小曲折的微管结构,与土壤中的毛细结构类似。此外,层析滤纸的纤维呈定向排列 (图5)[15],与展开剂的展开方向一致。因此,在该方向上纤维的中空腔将相互串连成比其垂直方向更多的毛细管孔道结构,有利于流动相的展开。然而,若要了解毛细作用的实质,我们需要介绍界面化学的相关知识。

     作为流动相的正丁醇-水-冰醋酸体系的极性决定了其具有亲水性,使其与纤维表面的接触角小于90°,即流动相可在多羟基纤维素表面铺展,在滤纸的毛细 结 构 中 呈 凹 液 面,与图6 (a)中插入润湿性液体中的玻璃毛细管类似。凹液面边界上的每个点都受到3个界面张力的作用,其合力方向为图6 (b)中箭头所指方向。当以凹液面整体为受力分析对象时,其边缘各点在水平方向的分力相互抵消,而在竖直方向上则不能抵消,单位面积上产生的合力称为附加压强,其数值与液体的表面张力成正比,与凹液面的曲率半径 (r)呈反比,其表达式为 Δp=2σ/r。附加压强的存在导致管内外压强不等,毛细管中的液面就会上升,直到与重力作用重新 达 平 衡 为 止, 爬 升 高 度 可 表 示 为 h=2σ/ρgrcosθ,其中ρ为 管 中 液 体 密 度,g为 重 力 加 速度,θ为 接 触 角,在 纸 色 谱 中 当 流 动 相 组 成 一 定时,其值则一定。


     层析滤纸的天然毛细管结构内径极细,非肉眼可见,甚至可达纳米尺寸,导致其内部的凹液面曲率半径亦极小,因此流动相可以爬升至足够的高度来完成样品的分离。显而易见,滤纸的薄厚和纤维疏密的均一性会影响到滤纸中的毛细管结构,导致流动相的流速不均,进而影响到分离效果。正因如此,生产滤纸时可通过调整厚薄和纤维疏密程度来控 制 流 动 相 在 滤 纸 的 展 开 速 度。 Whatman、Schleicher和国产新华滤纸是纸色谱分离中较常用的层析纸,不同型号则流速不同,可根据样品组成作出合适的选择。

4 流动相中酸 (碱)和水的作用

     纸色谱分离氨基酸的实验中,流动相是饱和了水的正丁醇弱酸性溶液,其中的弱酸和水在分离过程中发挥了举足轻重的作用。

     天然氨基酸作为被分离样品溶解在水溶液中,一般可有3种存在形式,即偶极离子形式、酸式解离的负离子形式和碱式解离的正离子形式,如图7所示。天然氨基酸按所带氨基和羧基的数目可分为酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸3类。在被人类广泛认识的20多种氨基酸中,以氨基和羧基数目相等的中性氨基酸最为常见,并且其羧基的酸式解离略大于氨基的碱式解离,最终使溶液呈酸性。因此,常常研究的氨基酸混合体系中,酸式解离生成的氨基酸负离子因静电等作用将与固定相产生过强的相互作用,容易造成拖尾现象。为减弱氨基酸与水的作用强度,增大其在流动相 (正丁醇)中的分配系数,在流动相中加入少量的醋酸或甲酸等弱酸可使氨基酸的酸式解离平衡朝左移动。反之,若分离碱性氨基酸混合体系,则要在流动相中加入一定量的弱碱,以抑制氨基酸的碱式解离。

     天然氨基酸均为 L 构型,在此以 L-甘氨 酸、L-丙氨酸和 L-苯丙 氨 酸 这 个 较 常见 的 氨 基 酸 混 合体系为例,来说明水在流动相中的作用。量子化学对以上3个氨基酸偶极矩的计算结果分别为1.195D、0.903D和0.535D[16],而 水 和 正 丁 醇 的 偶 极矩分别为1.85D和1.66D。流动相和固定相之间极性有所差异是实现纸色谱分离的必要条件,显而易见,被分离样品的极性均弱于正丁醇,正丁醇相已不必再通过加水来增加其极性,以实现对氨基酸的增溶作用。一般来说,当正丁醇从水相萃取某组分时,也需要将正丁醇制成被水饱和的溶液方可获得良好的萃取效果。一方面,水可以增加正丁醇相的极性,使水相中的极性较强物质更易向正丁醇相转移,另一方面则是防止正丁醇从水相吸收水分,导致某些组分在水相中因过饱和而析出。纸色谱流动相中水的作用与后者颇有相似之处。如若流动相没有被水饱和,必将在层析过程中从滤纸中不断吸收水分,作为固定相的部分水被携带,则 “固定相”不再是固定相,其与流动相之间无法产生相对运动,势必造成较差甚至失败的分离结果。反之,被水饱和的正丁醇溶液从宏观上看则不会在展开过程中携带滤纸中的水分,色谱中原有的吸附水 (无论是“结合水”还是 “自由水”)则都固定在滤纸上,在与流动之间相对运动中最终完成混合样品的分离。

5 结论

     纸色谱分离氨基酸实验在生物、医学等本科专业中的实验教学中具有至关重要的地位,深刻理解被分离各组分、固定相和流动相3者之间的相互作用,是理解纸色谱工作原理的关键。因此,纸色谱固定相的存在方式、流动相向上迁移的原动力以及2者何以实现严格的相对运动,甚至还包括氨基酸结构对分离效果的影响都成为笔者在此文重点剖析的内容,希望这些能消除学生在理解该实验时所遭遇的困扰。

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