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纤维素降解细菌对玉米秸秆的降解效果

2019-10-28 16:51:05      点击:

     秸秆是农作物经过传统农业初步利用后的副 产品, 并且是主要的有机废物之一。全球每年产生约 7. 4×107 t 的干秸秆[ 1] , 其中, 玉米秸秆数量最大。然而, 这些秸秆并没有得到很好利用, 一部分秸秆直接在田间焚烧, 造成环境污染和资源浪费[ 2-5] 。另外, 秸 秆 可 作 为 重 要 的 有 机 肥 源 物质[6-7] , 但因秸秆的主要成分是木质纤维素, 其很难快速分解, 这是限制秸秆“变废为宝”的关键难题[ 8] 。目前, 对木质纤维素的处理方法很多, 主要有物理、化学处理和生物降解[ 9-10] 。生物降解是通过微生物对秸秆进行发酵和酶解, 与物理、化学处理相比, 微生物处理没有二次污染, 更加安全, 并且能耗低、环保经济[ 11-12] , 微生物降解秸秆受到了广泛的关注。目前对放线菌和真菌的筛选及研究较多[ 13] , 王洪媛和范丙全[ 14] 筛选到 3 株具有较强降解纤维素的真菌菌株, 初步鉴定为草酸青霉、木霉和扩张青霉。李文哲等[ 15] 从腐烂竹子和玉米秸秆中分离出 Cro-2、Bam-Q、Bam-3、Bam-1 这 4 株降解纤维素能力较强的真菌。张晨敏[ 16] 利用羧甲基纤维素钠刚果红培养基筛选出 2 株高效低温纤维素降解菌, 经鉴定为链霉菌。Chang 等[ 17] 已经筛选了具有高效降解木质素能力的串珠镰刀菌菌株, 比传统的白腐真菌降解效果好。Chang 等[ 18] 从日本的森林土壤中分离出 2株具有碱木质素降解能力的芽孢杆菌菌株 CS-1和 CS-2。由于细菌繁殖快, 目前纤维素降解细菌对秸秆进行降解的研究已引起关注[ 19-21] 。

     本试验从自然界的土壤样品中分离出 2 株高效降解纤维素的细菌 CMC-red 和 CMC-I, 并对菌株进行分类鉴定, 采用室内秸秆降解以及大田堆腐试验, 以充分检验菌种在自然环境对秸秆的降解效果, 为秸秆类固体废弃物和秸秆资源的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 材料及培养基

     土样: 采自吉林农业大学教学科研基地多年堆积的腐烂秸秆堆里及附近土壤中。

     培养基: LB 培养基、富集培养基[ 22] 、CMC 培养基[ 16] 、液体发酵培养基[ 16] 。

1. 2 方法

     试验于 2016 年 4 月在吉林农业大学教学科研基地进行。采集的土壤样品首先在富集培养基上培养, 然后稀释涂布到 CMC 培养基上, 菌落长出后挑出单菌落。再将获得的菌株划线到 CMC培养基, 采用刚果红染色后, 测量透明圈和菌落的直径, 选择比值大的进行滤纸降解试验[ 23] 。将初筛菌株接种到 LB 培养基, 于 120 r /min、28 ℃ 条件下恒温振荡培养 18 h 后, 进 行 DNA 提 取 和PCR 扩增, 然后用 1% 琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR 产 物[ 24] 。菌 株 经 16S rDNA 测 序, 利 用BLAST 功能组件将测得的基因序列进行同源性比较和相似性较高的菌株选取, 采用 MEGA4. 0软件构建系统进化树[ 24] 。

     菌株的纤维素降解能力测定方法: 失重法、红外光谱和扫描电镜分析[ 25] 。

     采用固体发酵的方法来研究菌株对秸秆的降解效果, 将筛选出的菌种接种到含有秸秆的液体发酵培养基中, 28 ℃ 下进行恒温振荡培养 10 d,然后获取发酵液, 分别用滤纸过滤, 再将残留物在80 ℃ 下烘干后称重, 秸秆降解率采用减重法计算[ 24] 。

     取当年秋季农田中的玉米秸秆, 将秸秆处理成 5 ~ 10 cm 的小段, 称取 50 kg, 按秸秆重 1%进行接种, 设置 3 种处理: 未接种菌剂、接种 CMC-red 菌剂、接种 CMC-I 菌剂, 调节初始含水量约为60%, 每 5 d 翻堆 1 次。腐解 30 d 后取样, 采用扫描电子显微镜观察秸秆降解情况并进行秸秆腐解前后红外光谱测定。

2 结果与分析

2. 1 菌株的初筛

     采用刚果红染色后来测量透明圈和菌落的直径, 结果表明, 有 2 株菌株产生明显的透明圈, 菌株透明圈直径( D) 与菌落直径( d) 之比见表 1。CMC-red 的透明圈直径与菌落直径比为 5. 00 ±0. 71, CMC - I 的 透 明 圈 直 径 与 菌 落 直 径 比 为8. 20±1. 61, 在纤维素降解菌中 D /d 的值较高, 并且 CMC - I 的透明圈直径与菌落直径比要高于CMC-red。


2. 2 滤纸条崩解效果

     初筛获得的 D /d 较大的 2 株菌株, 对滤纸条降解结果见表 2。可以看出, CMC - red 菌株的“+”较多, 说明 CMC-red 对滤纸条的降解效果更好, 滤纸上长满菌落并溃烂成糊状; CMC -I 对滤纸条也有一定的降解作用, 并未成糊状。


2. 3 菌株分子鉴定

     以菌株 CMC-red、CMC -I 的基因组 DNA 为模板, 以 27F /1492R 细菌通用引物进行扩增, 得到 2 株菌株的 16S rDNA 序列。取 5 μL 的 PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳, 结果见图 1。扩增片段长约为 1 400 bp, 符合常规的 16S rDNA 序列长。将 2 株菌株的 16S rDNA 测序结果输入 Genbank 数据库中, 进行 Blast 比对, 选取同源性较高菌株的基因序列, 利用 MEGA4. 0 软件构建系统进化树, 序 列 比 对 结 果 见 图 2 和 图 3。可 见,CMC-red 与 Massilia arvi 菌属的遗传距离最近,CMC-I 与黄杆菌属( Flavobacterium banpakuense)遗传距离最近。


2. 4 秸秆降解情况

     通过 10 d 的发酵, 玉米秸秆颜色变黑, 且表面长满菌落, 测得玉米秸秆的降解率见图 4。整个降解过程中, CMC-I 和 CMC-red 的降解率均高于 ck, 2 d 时 CMC-I 和 CMC-red 的秸秆降解率差异不显著, 4 d 后 CMC-I 处理的秸秆降解率不及CMC-red。10 d 的 CMC-I 的降解率为 21. 06%,CMC-red 降解率可达 24. 14%, 说明该菌株具有较高的纤维素降解能力。


2. 5 腐解前后秸秆样品红外光谱分析

     菌株 CMC-red 和 CMC-I 对玉米秸秆降解前后的红外光谱见图 5。

     由图 5 可见, 2 株降解菌 CMC-red 和 CMC-I处理前后玉米秸秆的红外图谱形状比较相似, 但有些吸收峰的强度存在差异。CMC -I 和 CMC -red 腐 解 后 的 秸 秆 样 品 在 3 420, 2 920, 1 640,1 100 ~ 1 000 cm-1处吸收峰强度都有所降低。通过对比秸秆样品腐解前后的红外光谱可见, 经CMC - I 和 CMC - red 腐 解 后 的 秸 秆 样 品 在3 420 cm-1处的吸收峰强度比腐解前的秸秆样品明显减弱, 表明秸秆腐解后碳水化合物、羟基有所减少, 波数 3 420 cm-1 是纤维素分子内形成氢键的羟基伸缩振动, 导致纤维素分子内形成的氢键部分断裂, 使纤维素内聚力减小, 这主要指秸秆中纤维素发生润胀和溶解, 与 CMC -I 相比, CMC -red 的吸收峰强度更弱, 说明 CMC-red 降解后的秸秆羟基含量更低, 纤维素降解的更多。与未处理的秸秆样品相比, 2 920 cm-1 处吸收峰减弱, 说明 CMC-I 和 CMC-red 腐解后秸秆的甲基和亚甲基含量减少, 即脂肪族化合物被降解。1 736 cm-1为半纤维素的特征峰[ 24] , CMC-I 和 CMC-red 的特征峰仍然存在, 说明半纤维素在处理过程中得到一定程度的保留。1 640 cm-1处吸收峰减弱, 表示酰胺化合物含量减少, 木质素中与芳香环相连的 C O 伸缩振动减弱, 说明 CMC-I 和 CMC-red对木质素有一定的作用。1 100 ~ 1 000 cm-1 处吸收峰强度有所降低, 说明 CMC -I 和 CMC -red 降解后的秸秆碳水化合物( 纤维素、半纤维素) 或多糖含量降低。

2. 6 腐解前后秸秆形态分析

     通过扫描电镜观察秸秆腐解前后的表面形态变化( 图 6) 。ck 为腐解前的秸秆, 可见秸秆结构比较完整, 紧密相连, 纤维束均匀并且伸展。由CMC-I 和 CMC-red 降解的秸秆图像可见, 秸秆平整的表面被打乱, 密实的结构变得疏松。CMC -red 与 CMC-I 相比, 秸秆呈现断裂状, 表面出现大小不均的腐解孔隙。


3 讨 论

     纤维素是一种大分子物质, 由葡萄糖以β-1, 4糖苷键连接而成[ 25] 。通常, 初筛纤维素降解菌时采用刚果红染色法, 是因为刚果红和纤维素类多糖物质形成红色复合物, 当纤维素酶将纤维素分解后, 这种复合物就不能形成, 所以在培养基中形透明圈[ 26] 。一般可根据透明圈直径( D) 与菌落直径( d) 的比值大小, 来大致反映菌株产纤维素酶能力的高低。因此, 一些学者认为用刚果红染色法鉴别菌株降解纤维素能力更好, 张庆华等[ 27] 就是通过菌株在 CMC 平板上的透明圈大小比较, 来判断菌株的降解能力的。而徐春淼等[ 28]的研究结果表明, 菌株在羧甲基纤维素钠平板上透明圈直径( D) 以及 D /d 值与其对秸秆的降解效果均没有明显的相关关系。Chang 等[ 29] 也发现,木质纤维素酶大多数属于胞内酶, 一些没有降解秸秆能力的菌株也可能在刚果红平板上产生透明圈。因此, 菌株在羧甲基纤维素钠平板上的 D /d值并不是完全可靠, 需要进行筛选试验, 较为常用的方法中还有滤纸崩解试验[ 30] 。本研究中, 菌株CMC-red 的滤纸降解效果很好。通过玉米秸秆降解试验, 10 d 后玉米秸秆降解率为 24. 14%, 菌株纤维素降解能力较强。本试验中, 滤纸条崩解和秸秆降解率呈现出一定的正相关。本研究对2 株纤维素降解细菌的研究结果表明, 虽然 CMC-I 的 D /d 值高于 CMC-red, 但 CMC-red 对滤纸和秸秆降解效果更好。

     FTIR 常作为秸秆纤维结构和化学组分变化的表征因素[ 31] 。2 株降解菌 CMC-red 和 CMC-I对玉米秸秆处理前后在吸收峰的强度上存在一些变化。刘云鹏等[ 32] 研究表明, 在 1 050 cm-1 处吸收峰为秸秆纤维素和半纤维素的化学键, 本试验中峰值减弱说明经 CMC-I 和 CMC-red 降解后的秸秆中纤维素、半纤维素或多糖含量有所降低。波数 3 420 cm-1吸收峰的强弱能反映出秸秆羟基的含量高低, 与 CMC -I 相比, CMC -red 更弱, 含量更低, 纤维素降解效果更理想。扫描电镜能直观地反映出秸秆的腐解断裂情况。秸秆在加入菌剂后, 结构被分解, 出现裂隙, 微生物进入, 更加有效地接触秸秆表面, 加剧断裂, 加快秸秆腐解[ 33] 。

     本试验中在加入 2 种菌剂 30 d 后, 秸秆结构均出现断裂, 可以反映出 CMC-I 和 CMC -red 对秸秆的降解作用。

4 结 论

     ( 1) 本试验筛选到 2 株具有较强纤维素降解能力的细菌, 经 16S rDNA 序列分析, 初步鉴定菌株 CMC-red 为 Massilia arvi 菌属, 菌株 CMC-I 为黄杆菌属( Flavobacterium banpakuense) 。

     ( 2) 获得 1 株具有较高降解纤维素的菌株CMC-red, 室内 10 d 可将滤纸降解成糊状, 秸秆降解率为 24. 14%。大田秸秆堆腐试验中, 通过对比玉米秸秆腐解前后红外光谱和扫描电镜图可以得出, 经纤维素降解菌的降解, 纤维素、半纤维素的吸收峰减弱, 其纤维素结构被破坏, 从而变得疏松, 对秸秆具有较好的降解效果。

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