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芝麻茎点枯病菌 Macrophomina phaseolina 纤维素降解酶活性分析

2019-10-28 17:29:49      点击:

     芝麻是最古老的油料作物之一,在温带、热带地区广泛种植,也是我国重要的优质食用油源,我国芝麻单产和总产均居世界前列 [1]。但是芝麻单产不稳定,年份间、区域间差异比较大,除遗传因素外,病、虫、草等生物因子或渍、旱等非生物因子的胁迫,也是造成芝麻单产低而不稳的重要因素 [2],其中,茎点枯病是世界范围内危害芝麻最严重的土传、种传真菌病害之一。茎点枯病又称黑根疯、茎腐病、炭腐病等,病原菌首先从芝麻根部侵染,然后由根部向茎部蔓延,导致芝麻出现根腐、茎腐、果腐和叶部病斑并发的症状。在我国常年发病率 20%,严重的田块达到 80% 以上,重病田几乎绝产,不但影响芝麻的产量和品质,而且严重影响芝麻机械化生产 [3-4]。芝麻茎点枯病菌 为 菜 豆 壳 球 孢, 学 名 Macrophomana phaseolina(Tassi) Goid.,又名 Macrophomana phaseolina (Maubl.)Ashby,简称 M. phaseolinna,隶属于半知菌亚门、球壳孢目、球壳孢科 [5-6]。 M. phaseolina 抗逆能力很强 [7],寄主广泛,能侵染芝麻、大豆、向日葵、玉米、烟草、蓖麻、番茄、棉花等 500 多种植物 [8-9]。植物细胞壁是寄主抵御病原菌侵染的重要屏障,同时也是病菌与寄主互作的重要场所 [10],细胞壁降解酶是病原真菌的重要致病因子 [11],病原菌通过分泌细胞壁降解酶来降解组成寄主细胞壁的各种成分,不仅能为自身提供营养物质,而且有利于侵染寄主,然后在寄主组织中定植和扩散,进一步破坏细胞壁、胞间层,最终导致细胞分离和组织溃散 [12]。陈捷等 [13] 研究表明玉米茎腐病菌产生的细胞壁降解酶在胚根组织的降解中起重要作用;水稻纹枯病菌通过产生多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶和纤维素酶侵染水稻叶鞘 [14];陈尚武等 [15] 报道匍枝根霉能消解植物组织中胶层,细胞电解质外渗,导致质壁分离和腐烂现象;苹果腐烂病菌的果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶等细胞壁降解酶也是重要的致病因子 [16];植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等构成 [17],纤维素是植物中存在最广泛的骨架多糖,它由吡喃型葡萄糖残基以 β-1,4-糖苷键连接而成,与半纤维素和木质素相互缠绕、紧密结合构成植物细胞壁的主要结构。纤维素酶是一类能够水解纤维素多组分酶的总称 [18],主要由内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(CBH)、β- 葡萄糖苷酶(BG)等 3 种酶构成,其中:EG作用于纤维素内部,随机水解非结晶区 β-1,4-糖苷键,产生大量截短的、具有非还原性末端的小分子;CBH 作用于纤维素线状小分子末端,依次切下纤维二糖;BG 将纤维二糖、寡糖水解成葡萄糖 [19]。目前,国内外对茎点枯病症状的描述、发生规律和防治方法等研究较多,而对病原菌致病机制的研究相对薄弱 [20-22],因此,明确芝麻茎点枯病菌产生的细胞壁降解酶种类及活性,对进一步研究 M. phaseolina 与寄主的互作机制具有重要意义。本文通过测定 M. phaseolina 产生的纤维素降解酶及活性大小,进一步分析比较其变化规律,为芝麻茎点枯病菌致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

     供试菌株 M. phaseolina 7 株(表 1),于 2010-2011 年采集于河南、湖北、安徽、江西、江苏、辽宁等芝麻主产区,由河南省农业科学院植物保护研究所生物防治研究室分离和保存。pH 计为Sartorius PB-10,分光光度计为岛津紫外分光光度计 -UV2450;葡萄糖、水杨酸苷、羧甲基纤维素钠购自北京索莱宝生物科学技术有限公司,均为色谱纯。


     芝麻秆纤维素:芝麻秆洗净,蒸馏水冲洗两遍,80℃烘干,粉碎过 80 目筛,2mol/L NaOH 溶液( 固 液 质 量 比 为 1∶4) 处 理 12h, 水 洗 至 pH中性,烘干备用 [23]。液体发酵培养基:芝麻秆粉20g,NH4Cl 2.0g,KH2PO4 1.0g,MgSO4·7H2O 0.5g,Na2HPO4 0.2g,CuSO4·5H2O 0.007g,MnSO4 0.035g,FeSO4·7H2O 0.007g, 蒸 馏 水 1 000mL,pH 调 至6.8~7.0[24]。1%水杨酸苷缓冲液:1g 水杨酸苷溶解于 100mL 0.02mol/L pH4.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液中。无淀粉滤纸卷:1% 醋酸溶液浸泡定性滤纸条过夜,用碘液检验,再用 2% 的 NaHCO3 溶液洗至中性,干热灭菌后卷成 1cm×6cm 小卷 [25]。DNS试剂:6.5g 3,5- 二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中,加 入 325mL 2mol/L 的 NaOH 溶 液、45g 丙 三 醇,摇匀冷却后定容至 1 000mL[26]。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线 11 支洁净的 10mL EP管中分别加入一定体积的 2mg/mL 的葡萄糖标准溶液,不加标准溶液为空白对照,ddH2O 定容至2mL,配成葡萄糖梯度浓度溶液,摇匀后分别加入2mL DNS 溶液,再摇匀后沸水浴 5min,取出冷至室温。在 540nm 波长下测定吸光度(OD 值)。以葡萄糖浓度(mg/mL)为纵坐标,对应的吸光度为横坐标,绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.2 粗酶液制备 将斜面保存的菌株接至 PDA平板上,30℃黑暗培养 2d,从菌落边缘打菌饼转至新的 PDA 平板上,30℃培养 2d,菌落边缘打菌饼(ф=6mm)转接至含 200mL 液体发酵培养基的500mL 锥形瓶中,30℃、160r/min 振荡培养,以不接菌的液体发酵培养基作为空白对照,3 次重复,培养第 2 天取样 8mL,以后每隔 1d 取样 1 次,4℃ 10 000r/min 离心 10min,上清液即为粗酶液 [27],3,5- 二硝基水杨酸法(DNS 法)测定酶活力。

1.2.3 纤维素酶活测定 滤纸酶活力测定:洁净干 燥 10mL EP 管 中 加 入 无 淀 粉 滤 纸 卷 1 个, 然后加入 1.5mL 0.05mol/L pH4.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液,使滤纸完全浸在缓冲液中,再加入酶液0.5mL,50℃水浴中保温 1h,反应完毕后,立即取出,加入 2mL DNS 溶液终止酶反应,摇匀后沸水浴 5min,冰浴冷却,在 540nm 波长下测定 OD 值。天然纤维素酶活力测定:洁净干燥 10mL EP管中加入 50mg 芝麻秆纤维素,然后加入 1.5mL0.05mol/L pH4.8 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液,再加入酶液 0.5mL,50℃水浴中保温 1h,反应完毕后,立即取出,加入 2mL DNS 溶液终止酶反应,摇匀后沸水浴 5min,冰浴冷却,在 540nm 波长下测定OD 值。

     内切葡聚糖酶活力测定:洁净干燥 10mL EP管中加入 1.5mL 0.05mol/L pH5.0 柠檬酸缓冲液配制的 1%羧甲基纤维素钠溶液,再加入酶液 0.5mL,50℃水浴中保温 30min,反应完毕后,立即取出,加入 2mL DNS 溶液终止酶反应,摇匀后沸水浴5min,冰浴冷却,在 540nm 波长下测定 OD 值。外切葡聚糖酶活力测定:洁净干燥 10mL EP管中加入 50mg 脱脂棉,然后加入 1.5mL 0.05mol/LpH5.0 柠檬酸缓冲液,再加入酶液 0.5mL,50℃水浴中保温 1h,反应完毕后,立即取出,加入 2mLDNS 溶液终止酶反应,摇匀后沸水浴 5min,冰浴冷却,在 540nm 波长下测定 OD 值。

     β- 葡萄糖苷酶活力测定:洁净干燥 10mL EP管中加入 1.5mL 1%水杨酸苷缓冲液,然后加入酶液 0.5mL,50℃水浴中保温 30min,反应完毕后,立即取出,加入 2mL DNS 溶液终止酶反应,摇匀后沸水浴 5min,冰浴冷却,在 540nm 波长下测定OD 值。

1.3 数据分析

     1mL 酶液 1min 催化底物水解生成 1μmol 葡萄糖定义为 1 个酶活力单位(U) [27],根据 OD 值,在标准曲线上查找葡萄糖浓度,再根据葡萄糖浓度计算出相应的酶活力。采用 SPSS 17.0 对试验数据进行统计分析,Duncan 新复极差法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

     以吸光度为横坐标,葡萄糖浓度为纵坐标,Excel 绘制标准曲线,得到葡萄糖对应线性方程为:y=0.2181x-0.0012( R2 =0.9994),从图 1 可以看到标准曲线线性关系良好,可用于酶活力测定。

2.2 纤维素酶活分析

     滤纸酶活性如图 2 所示,在培养 14d 内,取样 7 次,7 株 M. phaseolina 均能检测到滤纸酶活性,表明 7 个菌株均能分泌胞外降解纤维素的酶。各菌株酶活性均高于第 2 天测定结果,并且达到峰值的时间不同,其中 2010082 和 G243 菌株达到峰值所用时间最短,均在第 6 天,各菌株间峰值大小依次是:2010082>2010003>2010028>2010010>2010032>G243>2010064,其中:2010082 峰值最大(0.268U)、2010064 峰值最小(0.068U)。


     天然纤维素酶活性如图 3 所示,在培养 14d内,取样 7 次,7 株 M. phaseolina 均能检测到天然纤维素酶活性,均具有降解芝麻秸秆的能力,说明 7 个菌株均能分泌胞外降解芝麻秸秆纤维素的酶。各菌株酶活力均高于第 2 天测定结果,并且达到峰值的时间不同,其中 2010003、2010064 和G243 菌株达到峰值所用时间最短,均在第 6 天,各菌株之间峰值大小依次为:2010082>2010003>2010032>2010028>G243>2010010>2010064,其中:2010082 峰值最大(0.264U)、2010064 峰值最小(0.083U)。

     从图 4 可以看出,在培养 14d 内,取样 7 次,7 株 M. phaseolina 均能检测到内切葡聚糖酶活性,均具有在纤维素内部水解 β-1,4- 糖苷键的能力,说明 7 个菌株均能分泌胞外内切葡聚糖酶。各菌株酶活力均高于第 2 天测定结果,并且达到峰值的时间不同,其中 G243 达到峰值所用时间最短,在第 4 天,各菌株之间峰值大小依次为:2010082>2010003>2010028>G243>2010032>2010010>2010064, 其 中:2010082 峰 值 最 大(0.419U)、2010064 峰值最小(0.206U)。


     从图 5 可以看出,在培养 14d 内,取样 7 次,7 株 M. phaseolina 均能检测到外切葡聚糖酶活性,均能在纤维素线状小分子末端切下纤维二糖,说明 7 个菌株均能分泌胞外外切葡聚糖酶。各菌株酶活力均高于第 2 天,并且达到峰值的时间不同,其中 2010003、2010032 和 2010082 达到峰值所用时间最短,在第 6 天,各菌株之间峰值大小依次为:2010082>2010003>2010028>2010010>2010032>G243>2010064,其中:2010082 峰值最大(0.079U)、2010064 峰值最小(0.008U)。

     从图 6 可以看出,在培养 14d 内,取样 7 次,7 株 M. phaseolina 均能检测到 β- 葡萄糖苷酶活性, 说 明 7 个 菌 株 均 能 分 泌 胞 外 β- 葡 萄 糖 苷酶,将寡糖水解成葡萄糖。各菌株酶活力均高于第 2 天测定结果,并且达到峰值的时间不同,其中 2010003 达到峰值所用时间最短,在第 10 天,各 菌 株 峰 值 大 小 依 次 为:2010082>2010003>2010028>2010032>2010010>G243>2010064,其中:2010082 峰值最大(1.535U)、2010064 峰值最小(0.066U)。


2.3 A 值大小比较

     参照病害严重度进展曲线下面积(AUDPC)法 计 算 酶 活 性 发 展 曲 线 下 面 积(the area underenzyme activity progress curve,AUEAPC, 简 写 为A 值) [28-30],进行方差分析,以 A 值为评价指标,来反映 M. phaseolina 不同菌株纤维素降解酶在第2~14 天酶活力综合活性的大小。从表 2 可以看出,不同菌株滤纸酶 A 值差异达极显著水平,2010003和 2010082 的 A 值极显著高于其他菌株,2010003和 2010082 的 A 值之间差异不显著,其中 2010003最高,2010064 最低;不同菌株天然纤维素酶 A 值差异达极显著水平,2010003 和 2010082 的 A 值极显著高于其他菌株,并且 2010003 和 2010082的 A 值 大 小 差 异 不 显 著, 其 中 2010082 最 高,2010064 最低;滤纸酶和天然纤维素酶的 A 值说明菌株 2010003 和 2010082 分泌胞外降解纤维素的综合能力极显著大于其他菌株。进一步分析纤维素降解酶各组分活性大小,从表 2 可以看出不同菌株内切葡聚糖酶 A 值大小差异达极显著水平,说明病原菌在降解纤维素的过程中,不同菌株在纤维素内部水解 β-1,4- 糖苷键的能力大小不同,其中:2010082 最高,2010003 次之,2010064最低;不同菌株外切葡聚糖酶 A 值大小差异达极显著水平,说明不同菌株在纤维素线状小分子末端,水解纤维二糖的能力不同,其中 2010082 和2010003 极显著高于其他菌株;不同菌株 β- 葡萄糖苷酶 A 值大小差异达极显著水平,说明不同菌株将纤维二糖、寡糖水解成葡萄糖的能力大小不同,2010082 极显著高于其他菌株,2010003 次之。


3 讨论

     明确植物病原菌致病因子和作用机制,是解决植物病害防控的关键问题和主要理论依据。病原菌侵染植物过程复杂,其致病力大小及发病的快慢,不仅与植物自身抗病性有关,还与病菌致病性有关,在侵染初期,病原菌会遇到宿主细胞壁的阻碍,在病菌与宿主识别的过程中,病菌释放多种细胞壁降解酶利于其入侵,同时,病原菌的侵染也会诱导植物产生防御酶系和抗菌物质来抑制细胞壁降解酶,从而达到抗病的目的 [31]。以芝麻秸秆为唯一碳源的液体培养基,培养不同地区采集的 7 株芝麻茎点枯病菌,从培养液中制取的粗酶液都能降解滤纸纤维素和芝麻秸秆纤维素,说明这些菌株能够分泌胞外降解纤维素的全套酶系,最终将纤维素彻底降解为葡萄糖。从滤纸酶和天然纤维素酶活性变化趋势可以看出,同一菌株在不同时间降解纤维素的活性大小不同,在某一时段内,其活性大小有一个峰值,不同菌株的峰值大小不同,并且出现峰值的时间不同。参考病害发展曲线下面积鉴定小麦品种慢白粉病性方法,用 A 值来评价病原菌酶活力综合活性小,通过比较 7 株病原菌降解滤纸和秸秆纤维的 A 值大小,不同菌株 A 值差异极显著,2010003 和 2010082 纤维素酶活力综合活性极显著高于其他菌株,推测在 M. phaseolina 侵染寄主的过程中,受纤维素酶的影响,不同菌株侵染能力不同,2010003 和 2010082 侵染能力可能较强。 M.phaseolinna 纤维素酶活力综合活性大小是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β- 葡萄糖苷酶协同作用的结果,除遗传因素外,还受酶促环境的影响,任何一种酶活性的大小,都可能影响到病原菌降解纤维素的能力。进一步分析内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和 β- 葡萄糖苷酶活性,从酶活变化趋势可以看出:同一种酶活性随时间而变化,在培养第 2~14 天内有峰值出现,不同菌株峰值大小不同,并且出现峰值的时间不同。2010082 内切葡聚糖酶、β- 葡萄糖苷酶活力综合活性均是最高,都极显著高于其他菌株;2010082 和 2010003 菌株外切葡聚糖酶活力综合活性差异不显著,但都极显著高于其他菌株,与滤纸酶和天然纤维素酶总活性结果吻合,推测外切葡聚糖苷酶活性大小与纤维素酶活性大小密切相关。

     前人 [31-32] 研究表明,细胞壁降解酶是苹果腐烂病的主要致病因子,致病性强的菌株木聚糖酶活性显著高,并且酶活力峰值出现的也比较早。本研究从 7 株 M. phaseolinn 纤维素降解酶活性变化趋势,初步分析了 M. phaseolinna 滤纸酶、天然纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶活力峰值大小、出现峰值的时间及酶活力综合活性的高低,为 M. phaseolinn 与寄主的互作机制研究奠定了基础。推测 M. phaseolina 分泌的胞外纤维素降解酶系与 M. phaseolina 侵染芝麻和茎点枯病的发生相关,并且菌株 2010003 和2010082 致 病 力 较 其 他 菌 株 强。 要 彻 底 明 确 M.phaseolinn 产生的纤维素降解酶对病原菌入侵寄主、病斑扩展的影响及其致病机制,根据病原菌致病因子鉴定程序,还需将病原菌以及分离纯化之后的酶,接种活体芝麻,对病原菌的致病性强弱及致病性强弱与这几种酶的相关性进行进一步探讨 [33]。

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