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pH 值对酱油中呈味肽种类和呈味特性

2019-11-17 10:29:09      点击:

     酱油起源于中国,距今已有 2500 多年的历史,并已成为人们日常生活中不可或缺的一种调味品。酱油是以大豆或者豆粕等植物蛋白为原料, 辅以面粉、小麦、麸皮等淀粉质原料, 经过微生物发酵作用, 生产出的一种含有多种氨基酸、呈味肽、有机酸和还原糖且具有特殊色、香、味的调味品[1-4]。 酱油的滋味鲜美,主要是由于大豆蛋白或小麦蛋白在发酵酶解过程中分解产生的大量的呈味肽和游离氨基酸[5]。

     呈味肽是指能够改善或掩盖食品感官特性的寡肽类,其分子量一般低于 5000 Da[6]。目前,已知的呈味肽主要有咸味肽、酸味肽、甜味肽、苦味肽、鲜味肽以及浓厚感肽[7, 8]。其中,鲜味肽和浓厚感肽是酱油中重要的呈味肽[9, 10]。鲜味肽可以减弱苦味,具有显著的增鲜、增香作用; 浓厚感肽能够显著增加食物浓厚感、口感复杂性及丰富性等。呈味肽的呈味特性与其相对分子量,氨基酸组成、氨基酸序列、空间结构等有关[11-14]。 因此,研究酱油中的呈味肽,并对呈味肽的分子量及氨基酸序列进行测定分析,有助于进一步探究酱油中的呈味物质及其呈味机理。

     课题组前期研究发现高盐稀态酱油酿造前期对酱醪进行低温胁迫处理可促进米曲霉自溶;提高酱醪中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力,谷氨酸含量明显增加;提升了酱油原油的鲜味[15]。在此基础上, 本文利用固相萃取法( solid phase extraction, SPE)结合超高效液相色谱-质谱联用技术( ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS) 研究了不同发酵 pH 值对低温胁迫法生产酱油中呈味肽种类和呈味特性的影响,以期为高品质酱油的生产提供理论和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

     Oasis MAX 混合型阴离子固相萃取柱(6 mL/500 mg) 美国 Waters 公司;甲酸、乙腈(色谱纯)美国 Sigma 公司;甲醇、氨水、甲酸(色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;二氯甲烷(色谱纯)天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

     ME204E 分析天平 梅特勒-托力多仪器(上海)有限公司; TS100 微型旋涡混合仪器 杭州瑞诚仪器有限公司; HL-6 恒流泵 上海精科实业有限公司; UPLC-MS/MS 液质联用仪 美国 Bruker 公司。

1.3 方法

1.3.1 低温胁迫酱油的制备

     将已浸润的豆粕高温灭菌后与大曲混合,置于霉菌培养箱中进行制曲。将所得大曲平均分为两份,第一份按大曲重/水重为 1/2.5 混合均匀后, 酱醪发酵初期 9 d 放在 4℃冰箱进行控温发酵, 之后添加22%(w/w) 的食盐, 使最终醪液的盐浓度为 16%, 放在 25℃的恒温发酵箱进行保温发酵, 每 2~3 天用 10M NaOH 调控酱醪 pH 值为 6.5 左右,发酵 90 天,得到调控 pH 酱醪;第二份所有发酵条件均与第一份相同,但不调节 pH 值, 发酵 90 天,得到自然 pH 酱醪。

1.3.2 固相萃取技术分离呈味肽

     收集两组酱油样品,离心过滤,分别取 0.3 mL 稀释于 50 mL 蒸馏水中。

     参考 Frerot 等[16]的方法并稍作修改,采用 Oasis MAX 混合型阴离子固相萃取柱分离两组酱油样品中的鲜味肽和浓厚感肽。 洗脱出来的酸性组分经 0.22 μm 滤膜过滤后置于样品瓶中, 4 ℃低温保存。


1.3.3 超高效液相色谱分离待测样品:

     参考 Frerot 等[16]的 UPLC 分离条件并稍作修改, 条件如下: 分离柱为 C18 柱: 直径 2.2μm, 柱长2.1×100 nm;流动相 A: 0.1%甲酸-水溶液;流动相 B: 0.1%甲酸-乙腈溶液;流速: 0.3 mL/min;进样量: 3μL

梯度洗脱条件:

1.3.4 ESI-MS/MS 鉴定呈味肽

     酱油样品经高效液相色谱分离后,分流通过电喷雾界面,进入 bruker 高分辨质谱仪。采用 ESI 正离子扫描模式, 扫描范围在 50~1000 m/z。 采用高纯度氮气作为雾化气和干燥气, 干燥温度为 180 ℃,干燥气流速为 4.0 L/min。依据从头测序法和自动数据搜索法,对质谱结果进行离子碎片解析,从而推到出 50~1000 m/z 多肽的氨基酸序列。

1.3.5 定向合成呈味肽

     经 1.3.1-1.3.3 分离且鉴定出目标呈味肽,由上海强耀生物科技有限公司进行定向合成,合成的呈味肽纯度均在 95%以上。

1.3.6 呈味肽的基本感官呈味分析

     采用定量描述分析(QDA) [17]方法。参照 GB/T 16291.1-2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第 1 部分: 优选评价员》 的方法。 男性 7 名和女性 5 名, 年龄 25~45 岁, 在 23±2℃的感官评价室进行。标准溶液为 5 种,甜味(蔗糖, 1%),咸味(氯化钠, 0.7%),鲜味(谷氨酸钠, 0.35%),苦味(L-异亮氨酸, 0.5%),酸味(柠檬酸, 0.08%)。 合成多肽的浓度为 1%,感官评价采用九点线性标度法,从 0 到 9 分,分别表示无感觉、阈值感觉、感觉微弱、感觉中等、感觉强烈,绘制图表描述结果。

1.3.7 呈味肽的呈味阈值

     合成呈味肽的阈值采用滋味稀释分析法(TDA) [17]进行测定。合成呈味肽浓度为 1%,依据三角检验(triangle test, 1 个样品实验组, 2 个空白对照组),按照 1:1 逐步稀释。呈味肽的呈味阈值即为样品实验组刚好与另外 2 个空白对照组(纯净水) 区分开来的浓度,对各个感官品评员的结果取平均值。

1.3.8 呈味肽对酱油呈味的影响

     酱油标准品为海天味业市售酱油, pH 值为 4.75,氨态氮含量 1.2g/100ml,评分为 5 分。将合成呈味肽添加至标准品酱油溶液中,添加量为 0.03%(w/w),评价其感官效果。

1.4 数据处理计算

     实验均重复三次,使用 OriginPro 9.0、 Excel 2016 和 SPSS 16.0、软件对数据进行处理,并绘制成相应的图表。

2 结果与分析

2.1 不同酱油 pH 值的变化规律

     自然 pH 酱油和调控 pH 酱油酿造过程中 pH 值的变化如图 1 所示。酱醪发酵过程中,调控 pH酱醪的 pH 值始终维持在 6.5 左右,自然 pH 酱醪的 pH 值呈现不断下降的变化趋势。酱醪发酵过程中,自然 pH 酱醪的 pH 值一直降低可能是由于微生物生长代谢及其酶系进行的复杂生化反应,如乳酸菌生长可利用葡萄糖和柠檬酸产生乳酸和乙酸,从而降低酱醪 pH 值。

     调控 pH 酱醪的发酵过程中, pH 值处于中性和弱酸性,可以充分发挥米曲霉分泌的谷氨酰胺酶、中性蛋白酶的作用,对原料的蛋白质进行分解,从而提高氨基酸、总氮的生成率,增加酱油中小分子肽含量,达到提升酱油感官滋味的目的[18]。调控酱醪 pH 值可以明显改变酱醪的 pH 环境,最终影响酱油的质量。余自琳等[19]在 pH5.0~7.0 反应条件下对墨鱼进行酶解,随着 pH 值升高,游离氨基酸总量升高,美拉德反应产物苦腥味减弱,鲜甜味突出。康乐等[20]研究了 pH5.0~6.5 对牛肉酶解物美拉德风味特性的影响,发现随着 pH 的增加,大分子肽段含量降低,小分子肽段含量上升,醇厚感显著增加,说明 pH 值的增大使肽类降解速率加快。


2.2 固相萃取技术和 UPLC-MS/MS 分离鉴定酱油中的呈味肽

     Oasis MAX 是一种新颖的混合模式聚合物吸附剂,利用阴离子交换基团提取酸性化合物及其代谢产物。谷氨酸、天冬氨酸等属于酸性(鲜味)氨基酸,其侧链 R 基团为酸性基团(如 COOH、 SO3H),能够作为前体形成鲜味物质。含有如谷氨酸和天冬氨酸等鲜味氨基酸残基的寡肽,很可能具有显著的鲜味[21]; 而分子量小于 1 kDa 的 γ-谷氨酰肽很可能为浓厚感肽, 具有鲜味和轻微酸味[22, 23]。 因此, 这些物质很可能存在于呈酸性的组分中。结合 UPLC-MS/MS 技术,分离鉴定酱油酸性组分中呈味肽的氨基酸序列, 见表 3 和表 4。

     结果表明,调控 pH 酱油和自然 pH 酱油,多以小分子肽为主,经过 Oasis MAX 固相萃取柱提取后,酸性组分中所鉴定出的多肽均以含有酸性氨基酸 Glu 的小肽和 Asp 的小肽为主,如 EM、 ED、EE、 EDD、 EF、 LDP、 ESAY、 AELY、 FLET 等。此外,在调控 pH 和自然 pH 酱油中均鉴定出 ED、EE、 EDD、 SV、 EF、 FLET、 LLVVQ 和 ALVLL,表明酱油的发酵原料及工艺流程对呈味肽的种类也具有一定的影响。

     在这些鉴定出的呈味肽中,部分已经被报道具有较好的呈味效果,如 Glu-Glu 具有显著的鲜味,口感丰富;而 Glu-Phe 稍有涩味,口感丰富[24, 25]; QLLN、 LLVVQ、 ESAY、 AELY、 FLET、 FLTW、 ALVLL和 QVELF 为首次在酱油中鉴定出来。 因此,需要定向合成这些从酱油出鉴定出来的呈味肽,对其进行基本感官呈味分析和描述性评价系列实验,以进一步验证这些呈味肽的呈味效果及其鲜味增强作用、食盐的增强效应、酱油的增效作用。


2.3 呈味肽的呈味阈值及其特性

     采用 TDA 法对合成呈味肽的呈味阈值及其特性进行分析,结果如表 5 所示。

     从表 5 可知,调控酱醪 pH 发酵的酱油中获得的大部分呈味肽呈酸、鲜味,这是由于实验采用阴离子交换基团 SPE 柱对酱油中的酸性组分进行提取,仅小部分呈绵长的苦厚味。含有谷氨酸、谷氨酰胺残基的多肽中,大部分具有较低的呈味阈值,如 ED、 EE、 EF、 ESAY、 AELY、 FLET 阈值为 500mg/L,除 FLET 外,均表现出明显的鲜味和酸味,口感丰富, ESAY 还有利于浓厚感的延长; EM、EDD、 QLLN、 LLVVQ 的阈值较高,为 1000 mg/L,除 LLVVQ 具有苦厚味外,均表现出较明显的鲜味; QNM 的阈值最高,为 2000 mg/L,带有酸涩味。此外,含有缬氨酸残基的多肽,如 SV、 LLVVQ、ALVLL,均具有较突出的厚味。 LLVVQ, FLET、 FLTW、 ALVLL 中含有较多的苦味氨基酸残基,因而表现出较明显的苦味。

     自然酱醪 pH 发酵的酱油中合成多肽的呈味阈值和特性见上表,其中 ED、 EE、 EDD、 SV、 EF、LLVVQ、 FLET、 ALVLL 已在调控 pH 酱油中鉴定出,这表明不同发酵工艺对酱油成品中呈味肽的组成和含量具有一定的影响。其中 NVP、 LDP、 LL、 QVELF 和 QVELF 均包含脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等苦味氨基酸的残基,因而表现出较为明显的苦味。

     结果表明, 自然 pH 酱油发酵过程中, pH 值不断降低,谷氨酰胺酶、蛋白酶等活性不断降低,谷氨酰胺在非酶作用下主要转化为无味或微酸的焦谷氨酸,从而导致酱油中的呈味肽均呈现较为明显的苦味。调控 pH 酱油在发酵过程中,谷氨酰胺酶及中性蛋白酶活力较高,蛋白质被主要分解成小分子肽,如谷氨酰肽等,从而使酱油其鲜味有所改善。

2.4 呈味肽对酱油的呈味影响

     依据表 3 和表 4,选择离子响应强度较大的呈味肽,以 0.03%的浓度添加至酱油中,分析它们对酱油滋味的影响,结果见表 6。


     由表 6 可见,添加 0.03%的 ESAY 使酱油厚味显著提高,风味得到明显改善; QLLN 的增鲜效果显著; LLVVQ、 AELY、 FLET 均对酱油鲜味稍有增强; FLTW、 ALVLL 的添加未对酱油产生明显感官变化。 SV 的添加使酱油浓厚感突出,风味显著提高; QVELF、 ALVLL 对酱油的感官效果无明显影响。

     本文从两种不同酿造工艺的酱油中分离鉴定出多种小分子肽,主要为二肽、三肽、四肽等,呈味肽的呈味效果与分子量以及其含有的氨基酸残基种类有关。 Rhyu 等[26]对大豆提取液中的小分子肽进行研究, 结果发现分子质量为 500~1 000 Da 的酸性肽具有最强的鲜味,且结合型谷氨酸和天冬氨酸为鲜味的主要源。 Zhang 等[27]利用 UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 对花生分离蛋白水解物进行分离鉴定,得到六种新的呈味肽, DQR、 NNP、 EGF、 EDG、 TESSSE,其中 RGENESEEEGAIVT 是第一个发现的具有鲜味及鲜味增强能力的十四肽。赵阳等[28]从紫贻贝蛋白酶解液中分离纯化出的六肽 CSVQDQ 或QAVNFT,具有明显的鲜味。 Glu、 Gln、 Asp、 Asn 之间相互结合形成的多肽或它们与其他氨基酸形成的多肽,通常具有鲜味或厚味, Feng 等[29]从双孢蘑菇中分离出浓厚感肽 GLPD 和 GHGD,具有显著的厚味。 Liu 等[30]从酵母抽提物中鉴定出浓厚感肽 EV,添加到鸡汤中,能够协调各种味觉。在本章鉴定出的呈味肽中, ED、 EE、 EF、 ESAY、 AELY、 FLET 呈现出突出的鲜味,而 EM、 EDD、 QLLN 有较强的鲜味。含有 Val 残基的多通常具有显著的浓厚感,本文鉴定出的 SV、 LLVVQ、 ALVLL 具有较强的厚味,其中 SV 厚味阈值最低。

3 结论

(1) Oasis MAX混合型阴离子固相萃取柱对富集酱油中含谷氨酸或天冬氨酸的呈味肽有较好的效果。

(2) 从调控pH发酵的酱油中鉴定出14种呈味肽,从自然pH值发酵的酱油中鉴定出12种呈味肽,其中8种呈味肽(ED、 EE、 EDD、 SV、 EF、 LLVVQ、 FLET、 ALVLL)在两种酱油中均鉴定出来。其中QLLN、LLVVQ、 ESAY、 AELY、 FLET、 FLTW、 ALVLL和QVELF为首次在酱油中鉴定出来。

(3)调控pH值发酵的酱油中ED、 EE、 EF、 ESAY、 AELY、 FLET阈值最低,为500mg/L, 除FLET外,其他均表现出明显的鲜味和酸味,口感丰富, ESAY还有利于厚味的延长; SV厚味阈值最低,为500mg/L。自然pH值发酵的酱油中, SV、 LLVVQ 、 ALVLL具有突出厚味; LLVVQ、 FLET、 FLTW、ALVLL含有较多的苦味氨基酸残基,因而表现出较明显的苦味。

(4)定向合成 QLLN、 LLVVQ、 ESAY、 AELY、 FLET、 FLTW、 ALVLL、 QVELF、 SV,并以0.03%添加到市售酱油中,发现 ESAY 显著降低酱油咸味,提高酱油厚味; QLLN 增鲜效果显著; LLVVQ、AELY、 FLET 增鲜效果较为显著; SV 的添加使酱油浓厚感突出,风味显著提高。结果表明,调控 pH值发酵的酱油中含有较多良好呈味效果的小分子肽,使酱油具有更突出的鲜味和厚味,丰富协调酱油的口感。

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