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一个来自节丛孢菌的多糖单加氧酶的表达与表征

2019-10-28 17:52:16      点击:

     我国是纤维素生产大国,每年约有3亿吨农作物秸杆被焚烧以及3亿吨林木废弃物被浪费,因此充分合理地利用和开发纤维素对我国经济和社会发展有重要作用[1]。由于纤维素具有高稳定性,人类大规模的降解纤维素生产生物能源受到限制[2]。传统的化学降解法和物理降解法均很难达到高的降解率,反应条件通常需要高温高压等极端条件从而导致高能耗。以生物学为基础的酶降解法具有降解条件温和等优点,已成为科学家们研究的新热点[3]。最近科学家们发现了一种具有 氧 化 还 原 纤 维 素 功 能 的 多 糖 单 加 氧 酶(LPMO),将其归类为辅助酶活性家族[4](AA9),其可以在纤维素结晶区的糖链表面氧化裂解糖苷键,增加纤维素结晶区表面断裂端口的数量,提高纤维素酶的催化降解效率[5]。

     本课题组前期工作从土壤中筛选出一株具有降 解 纤 维 素 能 力 的 菌 株 Arthrobotrys sp.CX1[6]。该菌株能利用滤纸和微晶纤维素为碳源生长,破坏滤纸的纤维素结构。结合 Arthrobot-ryssp.基因组数据及差异转录组测序结果,获得了一个新来源的多糖单加氧酶 LPMO10331 基因,将其构建在毕赤酵母表达菌株 Pichiapasto-risX-33中,成功诱导表达出蛋白 LPMO10331,对其活性进行了一系列表征,以期为进一步研究和应用 LPMO 提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材 料

     菌株Arthrobotryssp.CX1,本实验室筛选及保藏;大肠杆菌 DH10B、巴 斯 德 毕 赤 酵 母 PichiapastorisX-33及表达载体 pPICZαA,获赠于中科院大连物理化学研究所赵宗保研究员课题组。质粒pMD18-T Vector克隆载体、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒 OneStepRT-PCR及限制性内切酶,大连宝生物有限公司。PCR 引物合成和 DNA 测序,吉林库美生物科技有限公司。BMGY 培养基(g/L):酵母浸粉1%,蛋白胨2%,100mmol/L、pH6.0磷酸钾缓冲液,酵母氮源(YNB)13.4%,甘油 1%,pH=6.0。BMMY培 养 基 (g/L):酵 母 浸 粉 1%,蛋 白 胨 2%,100mmol/L、pH6.0磷酸钾缓冲液,YNB13.4%,生物素4×10-7,0.5%~3%甲醇,pH=6.0。

1.1.2 仪 器

     梯度PCR仪,德国 Eppendorf公司;NanoVuePlus超微量分光光度计,GEHealthcareLifeSci-ence;DYY-7C型电泳仪,北京市六一仪器厂。

1.2 方 法

1.2.1 LPMO10331蛋白毕赤酵母 X-33重组菌株的构建与表达

1.2.1.1 重 组 质 粒 pPICZαA-LPMO10331 的构建

     以前 期 工 作 中 提 取 出 的 Arthrobotryssp.CX1总 RNA 为模板,上下游引物为10331-RT-F、10331-RT-R,引物序列详见表1。应用反转录试剂盒中的反转录酶 PrimeScript1stepEnzymeMix对LPMO10331基因进行反转录 PCR 扩增得到其cDNA 片段。为长期稳定保存cDNA 片段,利用rTaq酶对纯化后的LPMO10331基因进行两端加 A,形成黏性末端,同pMD-18T 质粒的T 末 端 进 行 连 接。 将 连 接 产 物 热 击 转 化 至E.coliDH10B感受态细胞中,挑取重组质粒,利用 Nde Ⅰ、EcoR Ⅴ进行酶切鉴定并将测序正确的质粒命名为pMD-18T-10331。利用 Restriction-freecloning技术[7],以构建好的pMD-18T-10331质粒为模板,RF-10331-F、RF-10331-R为引物(表1)进行两轮 RF-cloning,扩增产物 经 Dpn Ⅰ 酶 过 夜 消 化 后 电 击 转 化 至E.coliDH10B感受态细胞中。挑取重组转化子进行菌落 PCR 鉴定,将鉴 定 正 确 的 质 粒 命 名 为pPICZαA-LPMO10331。


1.2.1.2 pPICZαA-LPMO10331/X-33 毕 赤 酵母重组菌株的构建

     将 测 序 正 确 的 质 粒 pPICZαA-LPMO10331用 Sac Ⅰ 限 制 酶 进 行 线 性 化 后 电 击 转 化 至PichiapastorisX-33感受态细胞中,线性化和电击转化具体方法参见文献[8]。挑取6个不同的转化 子,应用引物 AOX-P1 和 AOX-P2,经 菌 落PCR鉴定,将正确的重组菌株保存于-80℃冰箱。

1.2.1.3 目的蛋白 LPMO10331的表达

     将pPICZαA-LPMO10331/X-33重组菌于固体 YPD 平 板 上 复 苏 培 养,挑 取 单 菌 落 接 种 于5mLYPD液体培养基中制成种子液。将种子液以1∶100的比例接入25mL 的 BMGY 培养基中培养至 OD600为2~6时,将酵母细胞全部转移至 100 mL 的 BMMY 诱 导 培 养 基 中,30 ℃、200r/min培养,每24h向其中补加3%的甲醇进行诱导表达,96h后结束发酵。以相同条件发酵培养的pPICZαA/X-33菌株作为对照。

1.2.2 LPMO10331酶活的表征

1.2.2.1 酶反应体系及条件

     在50mL三角瓶中加入9mL超滤浓缩5倍后的LPMO10331粗酶液,1mL10mmol/L的维生素C,40mgWhatmanNo.1滤纸。180r/min、50 ℃反 应12h。反 应 结 束 后,将 底 物 用 ddH2O清洗3次,60 ℃烘 干。以 空 质 粒 pPICZαA/X-33的转化菌株发酵液为对照,反应条件相同。

1.2.2.2 酶活检测

     将处理好的样品送到大连工业大学仪器分析中心进行SEM、XRD检测。

2 结果与讨论

2.1 LPMO10331蛋 白 在 毕 赤 酵 母 表 达 体 系 中的构建与表达

2.1.1 LPMO10331氨基酸序列比对

     从Arthrobotryssp.全 基 因 组 数 据 库 中 获 得LPMO10331基因,其 ORF为1020bp,GC占比50.7%,编码37.4ku的 蛋 白。氨 基 酸 序 列 通 过NCBI进 行 比 对 并 作 图,结 果 如 图 1 所 示。

     LPMO10331分 别 与 来 自 Cylindrobasidiumtor-rendii 的 LPMO 蛋 白 具 有 65% 同 源 性、Armillariasolidipe 的 LPMO 蛋 白 具 有 56%同源 性、Pleurotusostreatus 的 LPMO 蛋 白 具 有54%同源 性 以 及 Heterobasidionparviporum 来源的 LPMO 蛋 白 具 有51%同 源 性。结 果 显 示,LPOM10331与同家族的LPMO序列一致性较高。


2.1.2 LPMO10331基因片段的扩增结果

     以Arthrobotryssp.CX1总 RNA 为模板,通过反转录 PCR 扩增目的基因。琼 脂 糖 凝 胶 电 泳结果如图2所示。如图2所示,在1000bp左右有 清 晰 的 目 的 条 带。 将 连 接 质 粒 pMD-18T-10331测 序,结 果 显 示 LPMO10331 基 因 序 列 全部正确,表明成功得到LPMO10331基因。

2.1.3 pPICZαA-LPMO10331重 组 质 粒 的 构 建及鉴定

     对 通 过 RF-克 隆 构 建 得 到 的 重 组 质 粒pPICZαA-LPMO10331进行 PCR鉴定,结果如图3所示。用通用引物 AOX-P1和 AOX-P2进行扩增,由于通用引物均在重组质粒上,距离插入片段分别为341和156bp,PCR鉴定条带的理论大小应为1517bp。琼脂糖凝胶电泳结果如图3(a)所示,泳道1~3中条带大小正确且条带单一。进一步对重组质粒进行酶切鉴定,目的片段和质粒上分别含有 NdeI和EcoR V 酶切位点,pPICZαA-LPMO10331重组质粒理论上将被酶切为 1720和2832bp两条片段。如图3(b)所示,重组质粒被酶切后分别在2000和3000bp有条带,与预测结果一致。图3表明重组质粒 pPICZαA-LP-MO10331构建成功。


2.1.4 pPICZαA-LPMO10331/X-33 重 组 菌 的构建及蛋白表达将构 建 成 功 的 重 组 质 粒 转 化 到 表 达 菌 株PichiapastorisX-33中 构 建 重 组 表 达 菌 株。菌落 PCR结果如图4所示,显示6组重组转化子中3株转化子成功扩增出目的条带,大小正确,表明

菌株1、3、5为构建成功的重组菌株。

     分别对pPICZαA-LPMO10331/X-33重组菌株及对照 组 pPICZαA/X-33菌 株 进 行 蛋 白 表 达。如图5所示,在97.2和66.4ku之间实验组同对照组发 酵 液 对 比 存 在 一 条 差 异 蛋 白 条 带。蛋 白LPOM10331理论蛋白大小为37.4ku,而所表达蛋白比 其 大40ku,可 能 是 由 于 在 真 核 体 系 中 表达的蛋白被翻译后修饰造成的蛋白质量变大。

2.2 重组 LPMO10331酶的酶活鉴定

2.2.1 SEM 观察 LPMO10331处理滤纸后的形态变化

     通过SEM 检测酶作用滤纸纤维的表面结构变化,如图6所示。图6(a)与(b)对比可以看到,被酶液处 理 过 的 WhatmanNo.1滤 纸 纤 维 表 面的微纤维断端裂口数量明显增多,表明酶液对滤纸表面纤维素有作用。从两样品中随机选取一个断口放大到3000倍,对照组pPICZαA 发酵液处理后的端口处微纤维的崩解断裂现象不明显(图6(c)),而实验组 LPMO10331酶液处理过的断口可以明显看到外围微纤维的崩解断裂(图6(d))。

     结果表明,LPMO10331 酶 能 够 在 滤 纸 的 微 纤 维表面发生氧化还原反应,使纤维素多糖链发生崩解断裂。


2.2.2 XRD检测经 LPOM10331酶处理后滤纸结晶度的变化

     为进一步探究 LPMO10331酶液作用后滤纸结晶度的变 化,对 酶 作 用 后 的 滤 纸 进 行 XRD 检测,结果如图7所示。衍射图谱上有4个典型峰,与纤维 素 的 XRD 图 谱 相 吻 合。LPMO10331 酶液作用后的滤纸在2θ=22.5°处的峰高出现明显降低,说明被酶液处理过的滤纸结晶度明显降低。

     经计算,结 晶 度 下 降 了 8%,说 明 纤 维 素 发 生 断裂,与SEM 结果一致。


3 结 论

     本实验成 功 构 建 并 表 达 了 一 个 多 糖 单 加 氧酶,并利用SEM、XRD 等方法表征其活性。结果表明,多 糖 单 加 氧 酶 在 维 生 素 C 存 在 的 条 件 下,对滤纸等纤维素材料具有一定的氧化还原作用,在纤维素的表面产生多个断口,更有助于溶剂进入纤维素内部,导致纤维素的结晶度下降。本实验为进一步研究辅助酶活性家族 LPMOs在降解纤维素过程中的作用提供了一定的理论依据。

参考文献:

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